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海藻酸钙止血敷料与临床常用3种止血敷料体外细胞毒性的比较(二)

编辑:海藻酸钙敷料小编 来源:海藻酸钙敷料官网 发布时间:2017/6/15 15:49:05 浏览:99

背景:止血敷料是作用于创伤表面与人体组织直接接触,其生物相容性是评价敷料优劣的重要指标之一,以海藻酸钙敷料为原料的制备的止血敷料有着廉价、相容性好等优点己成为研究的热点。 目的:观察海藻酸钙止血敷料的细胞毒性 ,并与明胶止血海绵、纳吸棉、普通纱布等材料作对比。

1.4 实验方法

1.4.1 浸提液法

材料浸提液的制备 : 无 菌 操 作 下 , 分 别 称 量 海 藻 酸 钙 敷 料 、 明 胶 止 血 海 绵 、 纳 吸 棉 、 普 通 纱 布 材 料 , 放 入 15 m L 离心管中,加入DMEM高糖培养液作为浸提介质 ,使敷料 的 质 量 浓 度 为 100 g/L, 置 于 37 °C 、 饱 和 湿 度 、 体 积 分 数 为5%CO2培养 箱 中浸提48h,用0.22um微孔过 滤器 过滤 后 ,将 浸提 液装 入15mL离心 管 内,将上 述浸 提液用 DMEM 高糖培 养液 按体 积分数 75% ,50%,25%,10%梯度 稀释 , 置于4°C冰箱保存待用。

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L一929缅糟 生 线 : 将对 数 生长 期 的 L-929细 胞 按 5×10,4×10,3×10,2×10,1X10 L『1浓度配置成5种 细 胞悬 液 ,将每 种细 胞悬 液)JH8个 孔 ,每 孔 100 uL于96TL 板 , 置 于 培 养 箱 中 静 置 培 养 2 4 h 后 , 每 孔 加 入 C C K .8 检 测 剂 10wL,继续培 养4h,选择450nm波 长在 酶联 免疫检 测 仪上测定每孔吸光度值,绘制细胞生长 曲线,取对数生长 期的细胞确定实验所需的细胞浓度。

粥 魉 德 馏 移 : 将 L -9 2 9 细 胞 传 代 培 养 7 2 h 后 , 将 生 长 旺盛 的细胞用胰酶消化后移入 15 mL离 心管 中, 1 2 0 0 r/m in 离 心 5 m in , 除 去 上 清 液 , 加 入 5 m L 含 体 积 分 数 10% 胎 牛 血 清 的 DM EM 高 糖 培 养 液 , 用 移 液 管 反 复 吹 打 使细胞充分分散均匀,成为单个细胞悬液,绘制细胞生长曲 线 , 选 择 合 适 的 细 胞 浓 度 (3x10 L1), 细 胞 计 数 板 计 数 。 实验分绍与子 :取含体积分数10%胎牛血清的 DMEM高糖培养 液(空 白对 照组 )、含5%二 甲基 亚砜 的 D M E M 高 糖 培 养 液 (阳 性 对 照 组 ) 、 不 同 浓 度 梯 度 的 4 种 材 料 浸提液各3mL,分别置于6孔细胞培养板中,然后分别向 培养皿中加入 3×10L『1的L.929细胞悬液3mL,置于培养箱中培养24h,在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。 c c 8 法 敷 料 浸 提 液 对 L.929 细 瞻 的 毒 性 作 用 :

3xl0 L 的 细 胞 悬 液 接 种 于 3块 96TL培 养 板 上 , 每 组 接 种 6 孔 , 每 孔 100 pL, 将 培 养 板 置 于 37 °C 、 饱 和 湿 度 、 体 积 分 数 5 % C O ,培 养 箱 中 静 置 培 养 2 4 h 。 饥 饿 培 养 2 4 h , 待 细 胞 贴 壁 生 长 后 取 出 9 6 ~7 L 板 , 弃 去 原 液 , P B S 洗 涤 2 次 , 每 孔 加DMEM高糖 培养 基 100uL,放入培 养箱 继续 培养 。加 样培养24h,弃去原液 ,PBS洗涤2次 ,分别加入含体积分 数 1O% 胎 牛 血 清 的 D M E M 高 糖 培 养 液 (空 白 对 照 组 )、 含 5% 二 甲 基 亚 砜 I~ D M E M 高 糖 培 养 液 ( 阳 性 对 照 组 ) 、 不 同 浓 度 梯 度 的4种材 料浸 提液 正常 更换培 养液 ,每TL1oowL,置于培养箱中静置培养24h。培养24h后 取 出96-~L板 ,每孔 加 C C K -8 检 测 剂 1O U L ,置 于 C O 2培 养 箱 孵 育 3 h , 选 择 4 5 0 n m 波长在酶联免疫检测仪上测定每孔的吸光度 )值 ,实验重 复 3次 取 平 均 值 , 并 记 录 结 果 。

根据 公式计 算细胞 相对 增殖 率 :细 胞相对 增殖 率=实验 组 A 值 ,空 白 对 照 组 值 ×1O0 % , 评 价 不 同 浓 度 浸 提 液 对 细 胞毒 性 的影 响 。

材料浸提液对细胞存活率影响的评定方法参照国家标 准GB,1-16886.5细胞 毒性评 价在 0,1级 内可认 为符 合标 准:细胞相对增殖率≥100%,毒性0级;在75%一99%之间, 毒性 1级 ;在50%-74%之 间 ,毒性2级 ;在25%一49%之 间 , 毒 性 3 级 ; 在 1 % 一 2 4 % 之 间 , 毒 15 4 级 ; 0 , 毒 性 5 级 。 1.4.2 直接接触法绍艚.意 每:在细胞 培养 瓶 中用含体积分数 10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养小鼠成纤维细胞 L -9 2 9 , 制 成 3 x 1 0 L 1 的 细 胞 悬 浮 液 。

实验分组与于 毛 取18个60mm培养皿,在每个培养 皿 中加入2mL细 胞悬浮 液 ,孵育48h直 至其融 合成近 似 细 胞单层,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,每2d更换 新 鲜 培 养 液 , 将 18个 培 养 皿 分 成 6组 , 每 组 3个 培 养 皿 , 分 别 加 入 同 样 形 状 和 大 小 (长 1 .0 c m 、 直 径 0 .3 c m 圆 柱 )的 4 种 敷料材料及乳胶橡胶(阳性对照)材料与不加任何材料(空 白 对照组),使其与细胞单层直接接触 ,继续培养24h后观察 细胞形态变化并照相。 

1.5主要观察指标 各组细胞形态学改变及毒性分级。 1 .6 统 计 学 分 析 采 用 S P S S 1 7 .0 统 计 软 件 进 行 统 计 学 分析。细胞毒性实验中,不同材料各浓度组间比较使用单 因素 方差 分析 (两两 比较采 用LSD法 ):相 同浓度 下不 同敷料的比较采用独立样本t检验 ,相同浓度不 同浓度 比较采用 单 因 素 方 差 分 析 ( 两 两 比 较 采 m L S D '~ ) 。 P < 0 . 0 5 为 差 异 有 显著性意义,计量资料用 s表示。 

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