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海藻酸盐敷料止血作用及生物相容性研究

编辑:藻酸盐敷料小编 来源:藻酸盐敷料官网 发布时间:2017/5/23 8:53:20 浏览:176


摘要:目的研究海藻酸盐敷料的止血性能,并初步探究其生物相容性。方法采用凝血指数试验测定 海藻酸盐敷料的体外凝血性能。采用新西兰兔耳和背部创伤止血试验测定海藻酸盐敷料的止血性能。 采用溶血试验和细胞毒性实验对海藻酸盐敷料的安全性进行初步评价。

结果凝血指数试验中海藻酸 盐敷料、明胶海绵的凝血指数BCl分别为33.1士4.9、72.O士3.3,与明胶海绵比较,凝血效果优于明胶 海绵(p<O.05)。在背部创伤出血模型中,海藻酸盐敷料、明胶海绵、纱布的平均止血时间为(80.2士7.4) s、(80.2士7.4)s、(10l士14.7)s,Hb光度吸收值分别为1.5士0.7、2.5士o.5、3.8士0.7。与明胶海绵比较,海藻酸盐敷料的平均止血时间缩短了31.05%,Hb光度吸收值降低了40.00%,(p<0.ol,p(O.05); 与纱布比较,海藻酸盐敷料的平均止血时间缩短了45.25%,Hb光度吸收值降低了60.53%,(p<0.01,

p<O.01)。在兔耳动脉止血实验中,海藻酸盐敷料、明胶海绵、纱布的出血量分别为(2.402)g (3.oO.2)g(3.9±0.2)g,止血时间分别为(226.36.5)s (332.314.2)s(466.519.1)s。与

明胶海绵组比较,海藻酸盐敷料的出血量降低了20.oo%,止血时间分别为缩短了31.90%(D<O.05,p<0.01);与纱布比较,海藻酸盐敷料的出血量降低了38.46%,出血时间缩短了51.49%(p<0.05, p<O.01)。溶血试验海藻酸盐敷料的溶血率低于5%。细胞毒性实验中各浓度的海藻酸盐敷料浸提液 为0级或1级,提示其对细胞无明显毒性。结论海藻酸盐敷料具有良好的止血效粜,溶血率符合国 标要求,且对皮肤成纤维细胞无细胞毒性。


关键词:海藻酸盐敷料;止血:生物相容性

海藻酸是从褐藻中提取的一种多糖,它是由p.(1,4).D.甘露糖醛酸和c.(1,4)-L-古罗糖醛酸两种 结构单元构成的线性共聚物。海藻酸本身不溶于水,与不同金属离子交联可形成各种海藻酸盐,如 与Na+K+交联可形成水溶性的海藻酸盐,Ca:+等高价阳离子交联可形成不溶于水的海藻酸盐【·】。 海藻酸钠水溶液可与高价阳离子(Ca,)进行离子交换,使之转换为不溶于水的海藻酸钙,这是海 藻酸盐纤维和海藻酸盐膜的技术基础【2】。

海藻酸盐具有良好的止血性能,大约在2~3min内即可产生止血效果f3】。龚静蓉I。】等对鼻内窥镜

手术中使用的鼻腔填塞材料进行了对比研究,认为商品名为Sorbalgon的海藻酸盐敷料适用于中小量 出血,术后鼻粘膜反应轻。Davies15】将海藻酸盐敷料与一般手术纱布的止血效果进行了对比,发 现使用一般手术纱布时手术中的流血量为140 mL左右,手术后的血液流失量为160 mL左右;而使用海藻酸盐敷料时的流血量为99 mL左右,手术后的血液流失量为97 mL左右,结果显示了海藻酸 盐敷料优越的止血性能。


本文主要研究了海藻酸盐敷料止血作用,并对其进行了血液相容性评价。为该产品的功能开发 提供研究基础。

材料与方法 1.1材料

海藻酸盐敷料(淄博奈琦尔生物科技公司),吸收性明胶海绵(金陵药业股份有限公司),胶原 海绵(上海吴海生物科技股份有限公司),氰化高铁血红蛋白检测试剂(天津现代高科技研究院中山 研宄所),文齐氏液(天津现代高科技研究院中山研究所),戊巴比妥钠(上海博光生物科技有限公 司),环磷酰胺(大连美仑生物技术有限公司),苯酚(国药集团化学试剂有限公司),塞坐蓝(M上海维编科贸有限公司),二甲基亚砜(上海博光生物科技有限公司),GIBCO RPMI1640培养基

(1nviogen公司),新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)。人皮肤成纤维细胞,本实验室原代

培养。新西兰兔,雄性,2.7±0.2kg(购自第二军医大学动物实验中心) 1.2仪器

759型紫外分光光度计(上海奥普勒仪器有限公司),C02培养箱(美国丁he肿。公司),酶标仪 (美国Thernlo公司)

海藻酸盐敷料止血作用及生物相容性研究(一)

1.3方法

1.3.1 体外凝血性能测定

采用凝血指数BcI(Blood Clotting Index)评价凝血性能【6Jo将海藻酸盐敷料,明胶海绵,均剪成1 cm×1 cm的方块,放入烧杯中,37°C水浴5 min;加入25}lL的新鲜抗凝兔血后,再加20 pL 0.2mol/L氯化钙溶液孵育5 min,加入25 mL的去离子水,37°C60 r/min震摇5min,取上清于540 nm测吸光度值。直接将25此新鲜抗凝兔血加入到25 mL去离子水中作为对照。BcI(%)=loo׉。/A!。每个样品重复平行试验3次。

1.3.2 背部创伤止血实验

选取健康雄性成年新西兰兔,分为海藻酸盐敷料组、明胶海绵组、纱布组。实验前一天进行背部脱毛。

30 mg/l(g于兔耳缘静脉缓慢注入3%戊巴比妥钠进行动物麻醉。沿脊柱两侧对称性剪直径约 1.8 cm 3个圆形切口,深度至筋膜层,每个切口切开皮下组织中的一根大血管,待伤口出血后立即

敷上与创面大小相当的敷料,记录止血时间。然后将敷料放入5 mL氰化高铁血红蛋白检测试剂中仔 细清洗,用紫外分光光度计于540 nm测量吸光值【7】。

.3.3 兔耳动脉止血实验【81 选取健康雄性新西兰兔,分成医用纱布组、明胶海绵组、海藻酸盐敷料组。将新西兰兔耳部脱

毛、消毒,30 mgg体重于兔耳缘静脉缓慢注入3%戊巴比妥钠进行麻醉。在耳外侧三分之一处用灭菌手术刀切长为1 cm的创口,使耳中央主动脉切开但不切透,3 s后创面充满血立即敷上事先 称重的止血材料(2 cm×3 cm),并覆盖上称过重的医用纱布,50g砝码进行压迫止血。覆盖敷料的 同时开始计时,并用称量好的棉花吸走周围渗血,lO s计时一次,若创口20 s内不渗血则止血结

束。待止血结束后立即精确称量止血材料及覆盖在上面的医用纱布。出血量(m)=止血后的质量(m:) 一止血前的质量(m)

1.3.4 细胞毒性试验 供试品及阴性对照分别设立相对浓度为100%,80%,60%,40%,20%5个剂量点;另设2组阳性对照及空白组,每组设3个复孔。 将处于对数生长期的人体皮肤成纤维细胞,按照1.8x103个/mL的浓度加入96孔板中,37 ,5%c02培养箱中培养24 h后,每孔加入20此试样,其中空白组加入等体积的培养基。在培养箱 中继续培养48 h后,每孔加入20此M1vr培养4 h,吸去孔内液体,每孔加入200 uL DMSO震荡 10 min。于570 nm测定吸光度。


细胞相对增殖率(relve growrate,RGR)%=样品吸光度/空白组吸光度×100%。根据细胞毒 性等级判定细胞毒性级别,其中阳性对照不得低于3,阴性对照不得高于l级。以5%苯酚、0.01g/mL环磷酰胺为阳性对照,以胶原海绵为阴性对照。细胞毒性等级数为0~1级为合格,2级应结合 细胞形态判定,3~4级为不合格。


1.3.5 溶血试验

8 mL新鲜抗凝兔血用10 mL生理盐水稀释。把海藻酸盐敷料剪成0.5 cm×O.5 cm的方块放入试管中,加入lOmL生理盐水37 水浴30min,然后加入0.2mL的稀释后的兔血,轻轻摇匀,37 水浴60min,1000 r/min离心5min。吸取上清于545nm测吸光值。阳性对照用lOmL蒸馏水加0.7 mL稀释兔血,阴性对照用生理盐水lO mL加入0.2 mL稀释兔血,操作方法同前。每组做5个平行 样。 结果计算:溶血率%=(A.B)/(C.B)×100%,其中A代表供试品吸光度,B代表阴性对照吸光度, C代表阳性对照吸光度。GB厂r 14233.2规定阴性对照吸光度不得大于0.03,阳性对照的吸光度值应 为O.8士O.3。


结果 

2.1凝血指数.

海藻酸盐敷料的体外凝血指数为33.14.9,显著低于明胶海绵的72.03.3(p<O.05),说明海藻 酸盐敷料的体外止血作用明显优于明胶海绵。

2.2背部创伤止血效果 

海藻酸盐敷料的止血时间为(55.35.1)s,与纱布的(10114.7)s和明胶海绵的(80.27.4)s比较,对兔背部创伤出血的止血时间均非常明显缩短(O.01)。海藻酸盐敷料组HbAso。。为1.50.7,也非常明显低于纱布组的3.8O.7(p<O.01),明显低子明胶海绵组2.50.5(p<O.05)。结果提示海藻 酸盐敷料的止血效果明显优于纱布及明胶海绵。

2.3兔耳动脉止血实验

海藻酸盐敷料的出血量为(2.40.2)g,显著低于明胶海绵组的(3.O0.2)g(p<O.05),极显 著低于纱布的(3.9O.2)g(p<O.01)。海藻酸盐敷料的出血时间为(226.36.5)s,非常明显低于明胶海绵组的(332.314.)s (p<O.01),明显低于纱布的(466.519.1)s(p<0.05)。 

2.4细胞毒性试验

除了20%的海藻酸盐敷料浸提液的细胞增殖率接近100%,其余各浓度的海藻酸盐敖料浸提液的 细胞增殖率均大于100%。除80%胶原海绵浸提液的细胞增殖率大于100%,其余各浓度均小于100%, 但仍大于75%5%苯酚、0.0lmL环磷酰胺的细胞增殖率分别为21.4%16.1%。说明海藻酸盐敷

料不会湿著影响细胞增殖,细胞相容性较好。 

2.5溶血试验

经计算海藻酸盐敷料的溶血率为1.55%,按照GBr4233.2规定溶血率低于5%即为合格,故海 藻酸盐敷料符合国标要求。

海藻酸盐敷料止血作用及生物相容性研究(二)

讨论 有研究报道海藻酸盐敷料具有良好的止血性能。彭中德f,D】等在背部创伤止血实验中发现海藻酸敷料的止血时间比云南白药创口贴缩短了50%,且出血量降低了38.4%,说明海藻酸盐敷料的止血效果优于云南白药创习贴。郭兴锋【,】等发现几丁糖/海藻酸敷料的止血效果优于明胶海绵且具有显著性差异(p o.01)。本研究发现海藻酸盐敷料的止血作用明显优于明胶海绵。可能有以下几点原因:1 吸液量不同:海藻酸盐敷料能吸收相当于自身重量15倍左右的液体[ ?,在体外凝血指数测定中发现 海藻酸盐敷料能迅速吸收血液,而血液在明胶海绵中在相同时问内不能被迅速吸收而停留在表面可能是由于其表面张力过大引起的。2止血机理不同:当伤口海藻酸盐与伤口渗液中的钠离子结合 形成凝胶,同时将钙离子释放出来,伤口表面钙离子的大量集结可加速创面止血【忙】,同时它还可以 增强血小板活性【吼:明胶海绵则是通过吸收数倍量的血液进入材料内,促使血小板破裂并释放大量 促凝血因子而达到止血的目的【H】。

海藻酸是一种天然多糖,无毒,故海藻酸盐广泛用于食品、医药、农业纺织等行业【”)。汪涛【16l 对海藻酸钙敷料进行体外细胞毒性试验发现不同浓度的海藻酸钙敷料浸提液对细胞无毒性作用。张 林朴【”】等制备的海藻酸钠/壳聚糖复合凝胶,24h,72h浸提液组的细胞毒性为O级和l,其细 胞毒性为合格。本研究发现除20%的海藻酸盐敷料对成纤维细胞的增殖有影响,其他浓度的海藻酸

盐敷料对成纤维的增殖无影响。 目前有关海藻酸盐溶血率试验的报道较少,本研究发现海藻酸盐敷料的溶血率为1.55%,低于GB/T4233.2规定的5%,说明海藻酸盐敷料对红细胞的影响较小。

综上所述,本研究进一步验证了海藻酸盐敷料的良好的止血效果以及优良的生物相容性,为海 藻酸盐进一步开发成各种生物材料研究基础。值得一提的是海藻酸来源广泛,这也为海藻酸盐的开 发提供了物质基础。

作者:李佳媚1,宗杰2,李娜2,张俊玲2,陈伟2,蒋定文2,葛卫红,沈先荣2

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